邻苯二甲酸酯高效降解菌的筛选及表征
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  同济大学学报(自然科学版)  2018, Vol. 46 Issue (7): 944-950.  DOI: 10.11908/j.issn.0253-374x.2018.07.012
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引用本文  

杨捷, 姚炎华, 尹大强, 叶秀云. 邻苯二甲酸酯高效降解菌的筛选及表征[J]. 同济大学学报(自然科学版), 2018, 46(7): 944-950. DOI: 10.11908/j.issn.0253-374x.2017.05.002.
YANG Jie, YAO Yanhua, YIN Daqiang, YE Xiuyun. Screening and Characterization of an Efficient Phthalate-Ester-Degrading Strain[J]. Journal of Tongji University (Natural Science), 2018, 46(7): 944-950. DOI: 10.11908/j.issn.0253-374x.2018.07.012.

基金项目

国家自然科学基金(31671795、41306120)、海洋生物酶工程创新服务平台(2014FJPT02)

第一作者

杨捷(1979—),女,工学博士,研究员,主要研究方向为应用微生物.E-mail: fjfzhyj@yahoo.com

文章历史

收稿日期:2017-09-17
邻苯二甲酸酯高效降解菌的筛选及表征
杨捷1, 姚炎华1, 尹大强2, 叶秀云1    
1. 福州大学 福建省海洋酶工程重点实验室,福建 福州 350116;
2. 同济大学 长江水环境教育部重点实验室,上海 200092
摘要:以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为唯一碳源,筛选得到一株能够降解DBP的菌株.通过形态学观察、16S rDNA测序及系统发育分析,鉴定该菌株为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.),命名为B3.首次报道了寡养单胞菌对邻苯二甲酸酯(PAEs)的降解作用.B3可高效降解0.05~50 g·L-1浓度范围的DBP,其中对0.05 g·L-1DBP的降解率为93.4%.经过优化后,在35 ℃、pH 8条件下对10 g·L-1DBP的降解率为95.8%.反应动力学研究表明,B3降解DBP符合一级降解动力学模型,对50 g·L-1DBP初始降解速率可达1.25 g·L-1·h-1.B3对其他4种常见的PAEs(邻苯二甲酸二(2─乙基己)酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二乙酯)和苯胺、甲苯、邻苯二甲酸的降解率均在50%及以上.B3降解PAEs浓度范围宽、底物种类范围广,表明B3在PAEs的生物降解中具有良好的应用前景.
关键词寡养单胞菌    邻苯二甲酸酯    邻苯二甲酸二丁酯    生物降解    降解动力学    
Screening and Characterization of an Efficient Phthalate-Ester-Degrading Strain
YANG Jie1, YAO Yanhua1, YIN Daqiang2, YE Xiuyun1     
1. Fujian Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116, China;
2. The Yangtze River Water Environment Key Laboratory of the Ministry of Education, Tongji University, Shanghai 200092, China
Abstract: With dibutyl phthalate (DBP) as the sole carbon source, we isolated a DBP-degrading strain; by its morphology as well as 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis, the strain was identified as Stenotrophomonas sp., designated as strain B3. Degradation of Phthalate esters (PAEs) by Stenotrophomonas was reported for the first time. The degradation efficiency of 0.05 g·L-1 DBP is 93.4%;B3 could efficiently degrade DBP up to 50 g·L-1, and under the conditions of pH 8, 35 ℃, the degradation efficiency of 10 g·L-1 DBP by B3 reached 95.8%. Kinetic studies showed that DBP degradation by B3 followed first-order kinetics, and the initial degradation rate of 50 g·L-1 DBP can reach 1.25 g·L-1·h-1. The degradation efficiencies of four other common PAEs(di-2-ethylhexylPhthalate、dimethyl phthalate、benzyl butyl phthalate、diethyl phthalate)as well as aniline, toluene and phthalic acid by B3 were 50% or higher, suggesting that B3 had a broad substrate spectrum. The ability of B3 to degrade various PAEs at high concentrations indicates that B3 is promising in bioremediation of PAEs.
Key words: Stenotrophomonas    phthalate esters    dibutyl phthalate    biodegradation    kinetics    

邻苯二甲酸酯类(phthalate esters,PAEs)作为塑料添加剂和软化剂广泛用于塑料产品、皮革、建筑材料、个人护理产品、洗涤剂、油漆等产品中[1].PAEs的一般结构由一个苯环和两个侧链组成,不同的PAEs的区别在于侧链基团的不同.PAEs的种类繁多,包括具有简单侧链基团的邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP),和具有复杂侧链基团的邻苯二甲酸丁苄酯(benzyl butyl phthalate,BBP)、邻苯二甲酸二(2─乙基己)酯(di-2-ethylhexylPhthalate,DEHP).在塑料制品中,PAEs以氢键或范德华力与塑料连接,这种不牢固的化学键使PAEs较容易从塑料中释放出来,造成了对大气、水体、土壤的污染[2].PAEs已成为全球最普遍的有机污染物之一,多种PAEs在全球主要工业国的生态环境中都达到了普遍检出程度,其中DBP、DEHP、DMP最常被检测出[3],浓度一般在mg·L-1级别.在增塑剂生产过程产生的污水属于高浓度有机污染废水,PAEs浓度高[4].

PAEs是一类具有类似于雌激素作用的内分泌干扰物,且对动物具有致畸性、致突变性、致癌性以及生殖毒性[5],具有低浓度长期危害特征.其污染控制己受到全球性关注,美国环保局(EPA)、中国环境监测总站及欧盟都将DBP、BBP、DEHP、DEP等多种PAEs列为优先控制污染物[6].

PAEs很难降解,在自然环境中通过水解、光解的速率非常缓慢.处理PAEs污染物的现有技术主要有吸附、光化学氧化、生物降解等.吸附法和光化学氧化法成本高,且容易造成二次污染.微生物降解是自然界中PAEs去除的主要方式,具有清洁经济的特点,得到科研人员的广泛关注[7].DBP作为最常用的PAEs,许多研究人员从环境中筛选DBP的降解菌.已报道的DBP降解菌普遍降解浓度较低,仅在mg·L-1水平,且降解其他(如长链)PAEs的效率不高[8-9],因此有必要筛选出降解能力更强、降解条件和底物范围更广的DBP降解菌,以提高微生物在降解PAEs中的应用价值.

本研究从土壤中筛选到能够高效降解DBP的菌株,通过生理生化以及16S rDNA等将其鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.),并测试其底物范围及探究降解DBP的条件、降解动力学,可为PAEs的污染治理提供理论支持.

1 材料与方法 1.1 材料

土样采自福建省福州市晋安区新店镇红庙岭垃圾综合处理场.试剂:DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和邻苯二甲酸、三氯甲烷(均为分析纯)、甲醇(色谱纯/分析纯)均购自国药试剂有限公司;用水为超纯水其余无机盐试剂均为分析纯.

基础无机盐培养基(mineral salt medium,MSM)(成分的单位:g·L-1):K2HP04 5.8 g,KH2P04 4.5 g,(NH4)2S04 2.0 g,MgCl2 0.16 g,CaCl2 0.02 g,Na2MoO4·2H2O 0.002 4 g,FeCl3 0.001 8 g,MnCl2·2H2O 0.001 5 g,pH 7.0.121 ℃高压灭菌20 min.

底物培养基:液体培养基是在试管中加入甲醇溶解的DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和邻苯二甲酸母液,水浴加热使甲醇蒸发,待甲醇完全蒸发后再加入MSM配制成所需浓度的各类底物液体培养基.DBP固体培养基是DBP液体培养基加2%的琼脂.121℃高压灭菌20 min.

1.2 降解菌的筛选

称取土样5 g于100 mL含5%的DBP液体培养液中,采用10%、15%、20%的DBP浓度梯度压力法驯化,30 ℃,150 r·min-1振荡培养7 d,再转接2 mL菌液至下一浓度梯度的DBP液体培养基培养.20%的DBP的菌液进行梯度稀释104倍后涂布于DBP固体平板上,30 ℃有氧恒温培养,通过划线在DBP固体平板上反复纯化,重复多次,直至菌落形态单一.挑取单菌落,在LB(Luria-Bertani)培养基中富集培养.

1.3 降解菌的分子生物学鉴定

用细菌基因组脱氧核糖核酸(DNA)提取试剂盒(OMEGA公司)提取细菌的总DNA,以其为模板,用16S rDNA特异性引物27F与1492R,进行16S rDNA扩增.

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,委托上海英潍捷基生物技术有限公司测序.将测序结果与NCBI数据库中Blastn程序进行序列同源性检索和比对,并通过MEGA7.0软件,构建系统发育进化树,分析确定该菌的分类地位.

1.4 PAEs的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)测定PAEs含量:将菌体与液体培养基8000 r·min-1离心3 min.用三氯甲烷分别对菌和液体进行两次萃取得到PAEs,待三氯甲烷挥发后,加入甲醇定容至5.0 mL.用孔径为0. 22 μm的有机相过滤器过滤后,用高效液相色谱仪(DGC-20A3R型,岛津公司)测定液体中PAEs的含量.

HPLC分析条件:色谱柱Agilent?ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm×5 μm),柱温35℃,流动相甲醇与水体积比为90:10,流速为0.5 mL·min-1,检测器波长为228 nm,进样量为20 μL.利用HPLC测定PAEs的残留量.

1.5 生长量的测定

取菌液1 mL,离心分离,用MSM重悬菌液,紫外分光光度计(T6系列,上海普析通用仪器有限责任公司)测OD600,即为菌株的生长量.

1.6 底物特异性

挑取在DBP固体培养基中生长良好的单菌落,置于LB液体培养基中30 ℃,175 r·min-1培养10 h.离心收集菌体、重悬,配制菌体浓度OD600 0.1.无菌条件下,吸取菌液,接种量于4 mL,8种10 g·L-1液体底物(DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和邻苯二甲酸)培养基中,pH 7、30 ℃、150 r·min-1摇床培养5 d.紫外分光光度计测定生长量,高效液相色谱法分析8种底物的残留量.

1.7 DBP降解条件的优化

分别探究不同的DBP初始浓度、pH、温度、摇床转速及葡萄糖添加量在72 h内对菌生长和降解DBP的影响.所有实验数据均为三次平行实验的平均值,数据采用Excel软件进行分析,图中误差线为三次平行实验的标准差.

1.8 降解动力学

分别探究初始质量浓度为1、5、10、20、50 g·L-1的DBP,在最佳培养条件下,每隔8 h测定72 h内DBP的残留量,每个样品设置三组平行.用软件GraphPad Prism5.0(GraphPad Software, Inc, USA)拟合实验数据,构建降解动力学模型,得出B3降解DBP的半衰期和速率常数.直观体现出时间和PAEs残留量的关系以及降解速率的变化.进一步研究出B3的降解DBP的特性,完善微生物降解PAEs有机污染物的研究.一级动力学模型可用方程表示:Y=(Y0-rPla)·e-Kt + rPlaY表示DBP的质量浓度, g·L-1; Y0为初始质量浓度,g·L-1rPla为无限时间后DBP残留质量浓度,g·L-1K为速率常数,半衰期t1/2 = ln 2/K,初始降解速率v0= dY/dt =(Y0-rPlaK·e-Ktt→0.v0的单位为g·L-1·h-1.

2 结果与讨论 2.1 降解菌的鉴定

经过富集培养,分离得到一株能够在以DBP为唯一碳源的基础培养基中生长良好的菌,命名为B3.观察菌落形态并通过结晶紫简单染色观察细菌,发现菌落呈黄绿色不透明,中等大小,表面粘稠,边缘平整,规则圆形,表面隆起,细长杆状.

扩增得到B3的16S rDNA序列,并构建系统进化树(图 1),B3与寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. KX928046.1)聚为一支,相似性为99%,同时结合该菌株的菌落形态特征,判定其为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.).据报道,寡养单胞菌能降解甲基对硫磷[10]、双对氯苯基三氯乙烷(DDT)有机农药[11]和四环素[12]等有机污染物,本研究筛选得到的能降解PAEs的寡养单胞菌为首次发现.

图 1 B3的系统发育树分析 Fig.1 Phylogenetic analysis of strain B3
2.2 底物特异性

将B3分别接种于如表 1所示的8种10 g·L-1底物液体培养基中,培养5 d后检测菌株的生物量(OD600)及底物的残留量,计算降解率.

下载CSV 表 1 B3的底物特异性 Tab.1 Substrate specificity of strain B3

B3在8种底物培养基中均能生长,其中在短链的PAEs(DBP、BBP、DMP)以及苯胺中生长较好(OD600>0.8),而在长链PAE(DEHP)中生长较慢,这种差异可能是由于各类PAEs侧链不同所引起的[8-9].B3对8种底物的降解率均在50%及以上,其中对BBP(90.1%)和苯胺(89.0%)的降解率最高,其次是DBP(75.9%)和DMP(73.0%).这表明B3的底物特异性不明显,能够降解多种PAEs及芳香类化合物.与B3类似,许多已报道的DBP降解菌更容易利用短链的PAEs,而对长链PAEs如DEHP的降解效果不佳:如Gordonia sp. strain QH-11[13-14]降解DEP和DBP的效果比长链的DMP、DIOP、DEHP的好;Camelimonas sp. M11[15]降解DPP、DEP、DBP的效率依次递减.B3降解10 g·L-1的长链DEHP的能力虽不比短链的好,但降解率仍有60%以上.

2.3 降解条件优化

首先探究底物DBP的初始浓度对B3生长和降解率的影响(表 2).表中,培养条件:pH为7,30 ℃,175 r·min-1,初始菌浓度OD600为0.05,反应时间为72 h.随着底物浓度增加,B3生长量在增长,当质量浓度大于10 g·L-1,呈缓慢下降趋势,表明B3对DBP具有很强的耐受性.DBP质量浓度为0.05 g·L-1时,降解率为93.4%,DBP浓度提高,降解率缓慢下降,可能是由于底物过剩,或是DBP本身具有毒性,随着其浓度增加对菌的抑制作用增强.当DBP质量浓度小于等于10 g·L-1时,B3降解DBP的效率均大于75%.当DBP质量浓度在20 g·L-1及以上时,降解率仍维持在70%左右.许多报道也研究了不同浓度DBP对菌的降解的影响:He[8]和Jin[13]等分别研究了0.6~1.2 g·L-1和0.1~0.75 g·L-1质量浓度范围的DBP对菌降解的影响.B3降解DBP浓度范围较前人的宽,而且效率高.表 2中,生长量以OD600表示(下同).

下载CSV 表 2 DBP初始浓度对B3菌株降解的影响 Tab.2 Effect of initial DBP concentrations on the degradation efficiency by B3

在10 g·L-1 DBP初始质量浓度下,探究pH、温度、摇床转速、接菌量和葡萄糖浓度对B3生长和降解DBP的影响(图 2表 3).图 2显示,B3的生长量和降解率呈现正相关.图 2a显示,30 ℃条件下,B3在pH为5~11,B3对10 g·L-1 DBP的降解率保持在60%以上,当pH由7上升至8时,B3的降解率由75.9%提高至92.2%,说明弱碱性的环境有利于B3对DBP的降解.Wu等[16]筛选出的Ochrobactrum sp. JDC-41在pH小于5或pH高于9,DBP降解率骤降至2%~35%.而B3在pH小于6或高于9的条件下,对DBP的降解率都超过60%,表明B3降解DBP受pH影响相对较小.

图 2 B3菌株降解DBP的条件优化 Fig.2 Optimization of conditions for the degradation of DBP by B3 strain
下载CSV 表 3 葡萄糖添加量对B3降解DBP的影响 Tab.3 Effect of glucose concentrations on B3 proliferation and DBP degradation

在pH 8的条件下探究温度对B3降解DBP的影响(图 2b).不同温度下菌株的生长量和降解率不同,这可能与菌体内酶的活性有关.20 ℃~45 ℃时,B3降解率均在60%以上,其中在25 ℃~35 ℃降解率大于80%,35 ℃时降解率最高,为94.1%.B3在温度40 ℃及以上时,对10 g·L-1 DBP仍具有70%以上的降解率,这与报道的降解DBP的eBrucellaceae、Sinobacteraceae[7]等菌株不同,这些菌降解的最适温度均在30 ℃~35 ℃间,但温度大于40 ℃或低于25 ℃时,降解活力大大降低.

图 2c摇床的转速反映了对B3降解DBP过程中的溶解氧的供给量,溶解氧供给量不足或是过量,好氧微生物的生长与代谢均会受影响.转速过低通气量不足,菌株的生长和降解效果不佳;随着转速提升,B3生长和降解速率增加,在转速175 r·min-1时B3菌株的生长量达到最高、降解DBP的效果最佳.转速高于175 r·min-1时,生长量和降解率均有所降低.Wu等[17]发现Gordonia sp.降解DBP的最佳摇床转速为175 r·min-1,而转速大于或小于175 r·min-1时,B3对DBP的降解效果降低,本文与该结果相似.与本文不同的是,Gordonia sp菌在75 r·min-1时,对0.4 g·L-1的DBP降解率只有20%左右,而B3在静置培养时,降解率仍有60%.

图 2d可知接菌量OD600小于0.125时,降解率和B3的生长量上升显著,当接菌量OD600大于0.25时,降解率和生长量提高不明显.接菌量OD600为0.05至0.25时,B3菌对10 g·L-1的DBP的降解率超过94.3%.

探究葡萄糖添加量对B3降解的影响(表 3),发现葡萄糖添加量≤0. 5 g·L-1时,对B3降解DBP有抑制作用.葡萄糖对于许多微生物而言是良好的碳源,微生物在含葡萄糖的条件下为了优先利用葡萄糖,会抑制其他碳源的代谢[18].Jin等[19]也探究了葡萄糖添加量对菌株降解DBP的影响,结果显示低浓度的葡萄糖抑制菌株对DBP的降解,这与本文结果相同.上述研究还表明高浓度的葡萄糖对菌降解DBP有促进作用,这与本文不同.因此得到结论,在B3降解DBP过程中没有必要添加葡萄糖.综上,B3降解10 g·L-1 DBP的最佳pH为8,温度35 ℃, 培养转速为175 r·min-1,接菌量OD600为0.125,在72 h内降解效率可达95.8%.

2.4 DBP的降解动力学

在最佳培养条件下,设置DBP初始质量浓度为1、5、10、20、50 g·L-1,每隔8 h测定DBP的残留量,以GraphPad Prism5进行数据拟合(图 3表 4),探究B3菌对DBP的降解动力学.

图 3 B3降解不同初始质量浓度DBP的降解曲线 Fig.3 DBP degradation profiles at different DBP initial concentrations
下载CSV 表 4 不同初始浓度DBP的降解动力学方程 Tab.4 Degradation kinetics equation of DBP with different initial concentration

实验结果表明,B3降解DBP符合一级动力学模型,降解速率与DBP初始浓度密切相关.初始浓度的增加,初始降解速率增大,当初始质量浓度为50 g·L-1时,初始降解速率可达1.25 g·L-1·h-1.DBP质量浓度小于等于10 g·L-1时,随DBP的浓度增大,半衰期缩短,降解速率常数增大;DBP质量浓度为10 g·L-1,降解速率常数达到最大(K=0.064),半衰期最短(t1/2=10.8 h);当DBP质量浓度为50 g·L-1时,半衰期增大,降解速率常数减小.一级动力学常用于有机污染物的降解动力学[20],He等[9]报道的赤红球菌属(Rhodococcus ruber strain),当DBP质量浓度小于等于0.8 g·L-1时,初始浓度的增加,降解速率增大,半衰期缩短;DBP质量浓度高于0.8 g·L-1时,随浓度增大,降解速率降低,半衰期增大,这些结果与本文结果相同.

近年来,探寻绿色高效经济的降解PAEs的方法已成为研究热点,已有很多报道降解DBP的菌属(表 5).许多研究报道的PAEs的降解率虽然可达90%,但降解的浓度通常在mg·L-1级别[21-22].Tang等[22]报道的根瘤菌(Rhizobium sp.)降解50 mg·L-1的效率大于90%,而当浓度升高时,降解率大大降低,当DBP质量浓度为400 mg·L-1时,降解率仅为50%左右.而在Chen等[15]报道中Camelimonas sp.在336h内降解0.03~0.14 g·L-1 DBP的效率不高于56%.在有些DBP降解浓度较高的报道中,菌降解时间长、效率不高亦或需要多种菌的共同作用:Kumar等[14]报道的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)在192 h内分别降解2 g·L-1 DBP的效率仅为57%、46%.本文筛选到的寡养单胞菌B3不仅在宽的浓度范围内保持着高效降解能力,而且降解的底物范围、温度、pH范围等条件均较宽.

下载CSV 表 5 不同的DBP降解菌的降解特性 Tab.5 Degradation characteristics of different PAEs by degrading bacteria
3 结论

本文筛选到的PAEs降解菌——寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)B3菌株,其对DBP的作用浓度和条件范围广.在30℃,pH 7条件下,B3在72 h内,对0.05~0.5 g·L-1 DBP的降解率在86%以上,降解0.05 g·L-1 DBP的效率为93.4%.在35 ℃、pH 8条件下,B3对1~50 g·L-1 DBP的降解率在72%以上,初始降解速率高,当DBP质量浓度在5 g·L-1及以上时,降解率仍维持在80%左右,降解浓度高且高效降解浓度范围宽.在20 ℃~45 ℃的温度及pH 5~11的范围中,B3菌株对10 g·L-1 DBP降解率保持在60%以上.在pH 8,35 ℃,175 r·min-1,接菌量OD600为0.125的条件下,对10 g·L-1 DBP的降解在72 h内可达到95.8%.B3降解DBP符合一级动力学模型.B3不仅对DBP具有高效的降解效果,而且对DEHP、BBP、DEP、DMP、苯胺、甲苯和邻苯二甲酸的降解率均在50%及以上,其中对BBP、苯胺的降解效果在88%以上.B3菌宽的降解浓度和底物种类范围预示着该株寡养单胞菌在PAEs的生物修复中具有独特的应用价值.

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